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气单胞菌(Aeromonas)属于革兰氏阴性菌,主要存在于各种水生环境中,分为致病菌株和非致病菌株,致病菌株可感染两栖类、鱼类、鸟类、哺乳类、爬行类等动物,常引起水产养殖动物的细菌性败血症[1],导致养殖的动物大量死亡,对水产养殖产业造成严重的危害。此外,气单胞菌还可引起人类的败血症、胃肠炎、伤口感染、腹腔感染、呼吸道感染等疾病[2-3],引发严重的公共健康问题。因此,探讨鳄鱼源气单胞菌毒力基因携带和耐药特性的关系,对其致病机制的理解,控制气单胞菌对鳄鱼养殖的危害有着重要的意义。自2016年以来,海南陵水、文昌等地多家鳄鱼养殖场发生了多起暹罗鳄死亡事件,研究人员己从发病鳄鱼体内分离到多株气单胞菌[4-6]。笔者对10株临床分离到的鳄鱼源气单胞菌菌株进行了相关的毒力基因和耐药基因的检测以及抗生素药物敏感性测定,旨在了解鳄鱼中气单胞菌毒力基因携带和耐药特性,为探讨鳄鱼源气单胞菌的致病机制,以及在鳄鱼养殖中该病的有效防治提供科学依据。
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酵母提取物,蛋白胨来自英国OXOID公司;抗菌药物药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒(Bacterial DNA Isolation Kit)购自北京华越洋生物科技有限公司;2×F8 Fast Long PCR Master mix为北京艾德莱生物科技有限公司产品;DNA 5000 Marker和DNA 2000 Marker来自广州东盛生物科技有限公司;琼脂糖凝胶为法国Biowest公司产品。
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病料样品来自于2016—2018年间海南文昌、陵水地区鳄鱼养殖场的18月龄以内的患病暹罗鳄鱼,经过分离培养、生理生化及分子生物学鉴定,获得了10株气单胞菌临床菌株,其中,包括5株嗜水气单胞菌,3株达卡气单胞菌,1株简达气单胞菌和1株维氏气单胞菌。
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分别挑取10株气单胞菌单菌落于LB液体培养基中在30 ℃下培养16 h,然后按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明分别对10株气单胞菌的基因组进行提取,通过Nanophotometer仪器测定其浓度和纯度,然后保存于−20 ℃冰箱中。
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以分离得到的10株气单胞菌的基因组为模板,利用毒力基因检测引物(表1)分别进行PCR扩增,反应程序为:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,47.4~55.4 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,30个循环;72 ℃ 终延伸10 min。9种毒力基因分别为:Ⅲ型分泌系统内膜组分基因(Type Ⅲ secretion system inner membrane component,ascV)、ADP−核糖基化毒素基因(ADP-ribosylating toxin,aexT)、胞外毒力因子气溶素基因(Aerolysin,aer)、细胞兴奋性肠毒素基因(Excitatory enterotoxin,alt)、细胞毒性肠毒素基因(Cytotoxic enterotoxin,act)、热稳定肠毒素基因(Heat stable enterotoxin,ast)、磷脂酶基因(Lipase,lip)、弹性蛋白酶基因(Elastase,ela)、鞭毛蛋白基因(Flagella,fla)。
表 1气单胞菌毒力基因引物
Table 1.Primers ofAeromonasvirulence genes
基因
Gene序列(5′−3′)
Sequence(5′−3′)长度/bp
Length退火温度/℃
Annealing temperature参考文献
ReferencesascV CTCGAACTGGAAGAGCAGAATG 577 52.2 [7] GAACATCTGGCTCTCCTTCTCGATG aexT ATGCAGATTCAAGCAAACAC 226 47.4 [7] TTGCCGATCCACTCTTTGAT aer CCTATGGCCTGAGCGAGAAG 430 54.7 [8] CCAGTTCCAGTCCCACCACT act AGAAGGTGACCACCAAGAACA 232 52.3 [9] AACTGACATCGGCCTTGAACTC ast TCTCCATGCTTCCCTTCCACT 331 52.5 [9] GTGTAGGGATTGAAGAAGCCG alt TGACCCAGTCCTGGCACGGC 442 55.4 [9] GGTGATCGATCACCACCAGC lip ATCTTCTCCGACTGGTTCGG 382 53.3 [9] CCGTGCCAGGACTGGGTCTT ela ACACGGTCAAGGAGATCAAC 513 51.0 [9] CGCTGGTGTTGGCCAGCAGG fla TCCAACCGTYTGACCTC 608 50.0 [9] GMYTGGTTGCGRATGGT 注:其中fla基因引物中的Y, M, R代表简并碱基,Y=C/T,M=A/C,R=A/G。
Note: Y, M and R in theflagene primer represent degenerate bases; Y=C/T, M=A/C, R=A/G. -
以分离得到的10株气单胞菌的基因组为模板,利用表2中的耐药基因检测引物分别进行PCR扩增,反应程序为:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,40.0~59.7 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,30个循环;72 ℃ 10 min。9种耐药基因包括:喹诺酮类药物耐药基因qnrA、qnrS;四环素类药物耐药基因tetA、tetC;氨基糖苷类药物耐药基因ant3、strA;磺胺类药物耐药基因sul1;β−内酰胺类药物耐药基因tem、ctxM。
表 2气单胞菌耐药基因引物
Table 2.Primers of antibiotic-resistant genes ofAeromonas
基因
Gene序列(5′−3′)
Sequence(5′−3′)长度/bp
Length退火温度/℃
Annealing temperature参考文献
ReferencesqnrA ATTTCTCACGCCAGGATTTG 519 49.4 [10] GATCGGCAAAGGTCAGGTCA qnrS ACGACATTCGTCAACTGCAA 417 51.0 [10] TAAATTGGCACCCTGTAGGC tetA GTAATTCTGAGCACTGTCGC 956 50.2 [10] CTGCCTGGACAACATTGCTT tetC TCTAACAATGCGCTCATCGT 588 50.5 [10] GGTTGAAGGCTCTCAAGGGC ant3 GTGGATGGCGGCCTGAAGCC 526 58.7 [10] ATTGCCCAGTCGGCAGCG sul1 CGGCGTGGGCTACCTGAACG 433 59.1 [10] GCCGATCGCGTGAAGTTCCG Tem AAAGATGCTGAAGATCA 425 45.0 [10] TTTGGTATGGCTTCATTC ctxM GTGCAGTACCAGTAAAGTTATGG 538 49.4 [10] CGCAATATCATTGGTGGTGCC strA TTGAATCGAACTAATAT 1640 40.0 [10] CTAGTATGACGTCTGTCG -
利用纸片扩散法(Kirby-Bauer法)进行气单胞菌的抗生素药物敏感性测定,通过产生的抑菌圈直径大小判定病原菌对药物的敏感性,根据美国临床和实验室药敏操作标准[11]可分为耐药(R)、中度敏感(I)和高度敏感(S)。抗菌药物药敏纸片主要包括β−内酰胺类抗生素中青霉素类氨苄西林、阿莫西林以及头孢菌素类头孢噻吩、头孢唑啉、头孢曲松;氨基糖苷类抗生素卡那霉素、链霉素、庆大霉素;四环素类抗生素米诺环素、四环素;喹诺酮类抗生素依诺沙星、萘啶酸、恩诺沙星、环丙沙星;磺胺类抗生素磺胺异恶唑、甲氧苄啶;糖肽类抗生素万古霉素;氯霉素类抗生素氯霉素、氟苯尼考;碳青霉烯类抗生素亚胺培南。
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以10株气单胞菌基因组为模板,利用9种毒力基因的引物分别进行PCR扩增,结果如表3所示,除ascV和aexT基因阳性检出率较低外,其余7种毒力基因检出率均大于50%,其中,lip和ela基因检出率高达100%。相比之下,嗜水气单胞菌中C1、C2、C3以及维氏气单胞菌C4这4株菌株毒力基因携带率较高,可以达到77.8%。
表 3毒力基因鉴定结果
Table 3.Identification of virulence genes ofAeromonas
气单胞菌Aeromonas 编号 Number ascV aexT aer act ast alt lip ela fla 嗜水A.hydrophila C1 − − + + + + + + + C2 − − + + + + + + + C3 − − + + + + + + + C6 − − + − + + + + + C10 − − + − + + + + + 达卡A.dhakensis C5 − + − + − − + + − C8 − − + − − + + + + C9 − + + − − + + + + 简达A.jandaei C7 − − − − + + + + + 维氏A.veronii C4 − − + + + + + + + 检出率/% 0 20 80 50 70 90 100 100 90 注:“+”表示检出,“−”表示未检出,下同。
Note: “+”represented detected, “−”represented non-detected, the same below. -
以10株气单胞菌基因组为模板,利用9种耐药基因的引物分别进行PCR扩增(表4)。从表4可知,9种耐药基因阳性检出率偏高,均大于50%。其中,嗜水气单胞菌C2和C3以及简达气单胞菌C7这3株菌里9种耐药基因携带率高达100%。
表 4耐药基因鉴定结果
Table 4.Identification of antibiotic resistant genes ofAeromonas
气单胞菌Aeromonas 编号 Number qnrA qnrS tetA tetC ant3 strA sul1 tem ctxM 嗜水A.hydrophila C1 + + + + + − + + + C2 + + + + + + + + + C3 + + + + + + + + + C6 + + + − − + + + + C10 + − + − + + + + + 达卡A.dhakensis C5 + + + − + + − + + C8 + + + − + + + + + C9 + − + + + + + + + 简达A.jandaei C7 + + + + + + + + + 维氏A.veronii C4 + + + − + + + + − 检出率/% 100 80 100 50 90 90 90 100 90 -
从表5可知,10株气单胞菌对喹诺酮类抗生素、四环素类抗生素、氨基糖苷类抗生素、氯霉素类抗生素和碳青霉烯类抗生素的敏感率较高,均大于60%,其中对庆大霉素、四环素、卡那霉素、依诺沙星、环丙沙星和氟苯尼考的敏感率高达90%以上;而对于β−内酰胺类抗生素、磺胺类抗生素和糖肽类抗生素耐药率较高,其中,对于阿莫西林、头孢噻吩、头孢唑啉和万古霉素的耐药率超过80%,但对三代头孢中的头孢曲松敏感率较高。
表 5药物敏感性鉴定
Table 5.Identification of antibiotic sensitivity
抗生素种类
Class of antibiotics药品名称
Antibiotics嗜水A. hydrophila 达卡A. dhakensis 简达A.jandaei 维氏A.veronii C1 C2 C3 C6 C10 C5 C8 C9 C7 C4 β−内酰胺类 头孢噻吩(30 μg·片−1) R R R R R R R R S I 头孢唑啉(30 μg·片−1) R R I R R R R R I R 阿莫西林(20 μg·片−1) R I R I R R R R R R 氨苄西林(10 μg·片−1) R R R R I I I R R I 头孢曲松(30 μg·片−1) S I I S S S I S S S 氨基糖苷类 链霉素(10 μg·片−1) R S S R S S S S S S 庆大霉素(10 μg·片−1) S S S S S S S S S S 卡那霉素(30 μg·片−1) S S S I S S S S S S 四环素类 米诺环素(30 μg·片−1) S I S S S I R I S S 四环素(30 μg·片−1) I S S S S S S S S S 喹诺酮类 依诺沙星(10 μg·片−1) S S S S I S S S S S 萘啶酸(30 μg·片−1) R I I I R S S S S S 环丙沙星(10 μg·片−1) S I S I S S S S S S 恩诺沙星(10 μg·片−1) S S S S S S S S S S 磺胺类 磺胺异恶唑(30 μg·片−1) R R R R R S R S I R 甲氧苄啶(5 μg·片−1) I R R R R R R S I R 糖肽类 万古霉素(30 μg·片−1) R R R R R R R R R R 氯霉素类 氯霉素(30 μg·片−1) S S S I I S S S S I 氟苯尼考(30 μg·片−1) S S S S S S S S S I 碳青霉烯类 亚胺培南(10 μg·片−1) S S S S I S S I R S 注:S. 高度敏感;I. 中介;R. 耐药。
Note: S: Sensitive; I: Intermediary; R: Resistant.
Characteristics of Virulence Genes and Antibiotic Resistance ofAeromonasspp. Isolated fromSiamese crocodile
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摘要:对海南地区患病暹罗鳄( Crocodylus siamensis)体内分离出的10株气单胞菌(5株嗜水气单胞菌、3株达卡气单胞菌、1株简达气单胞菌和1株维氏气单胞菌)进行了毒力基因、耐药基因的检测以及抗生素药物敏感性试验。结果表明:气溶素、肠毒素、蛋白酶等基因检出率较高,其中, lip和 ela2种毒力基因检出率高达100%;喹诺酮类、四环素类、磺胺类、 β−内酰胺类、氨基糖苷类耐药基因检出率大于50%;气单胞菌对喹诺酮类抗生素、四环素类抗生素、氨基糖苷类抗生素、氯霉素类和碳青霉烯类抗生素的敏感率较高,而对于 β−内酰胺类抗生素、磺胺类抗生素和糖肽类抗生素耐药率较高。Abstract:A total of 10 strains of Aeromonas spp.were isolated from sick Siamese crocodilein Hainan, including 5 strains of Aeromonas hydrophila, 3 strains of Aeromonas dhakensis, 1 strain of Aeromonas veroniiand 1 strain of Aeromonas jandaei, and tested for virulence genes, antibiotic resistance genes, and antibiotic susceptibility. The results showed that aerosol genes, enterotoxin genes and protease genes had a higher detection rate, of which two virulence genes, lipand ela, had a detection rate of up to 100% and the genes resistant to quinolones, tetracyclines, sulfonamides, β-lactams, and aminoglycoside had a detection rate of higher than 50%. Antibiotic susceptibility testing showed that Aeromonasspp.were more sensitive to quinolone, tetracycline, aminoglycoside, chloramphenicol and carbapenem antibiotics, and more resistant to β-lactam, sulfonamides and glycopeptide antibiotics.
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表 1气单胞菌毒力基因引物
Table 1Primers ofAeromonasvirulence genes
基因
Gene序列(5′−3′)
Sequence(5′−3′)长度/bp
Length退火温度/℃
Annealing temperature参考文献
ReferencesascV CTCGAACTGGAAGAGCAGAATG 577 52.2 [7] GAACATCTGGCTCTCCTTCTCGATG aexT ATGCAGATTCAAGCAAACAC 226 47.4 [7] TTGCCGATCCACTCTTTGAT aer CCTATGGCCTGAGCGAGAAG 430 54.7 [8] CCAGTTCCAGTCCCACCACT act AGAAGGTGACCACCAAGAACA 232 52.3 [9] AACTGACATCGGCCTTGAACTC ast TCTCCATGCTTCCCTTCCACT 331 52.5 [9] GTGTAGGGATTGAAGAAGCCG alt TGACCCAGTCCTGGCACGGC 442 55.4 [9] GGTGATCGATCACCACCAGC lip ATCTTCTCCGACTGGTTCGG 382 53.3 [9] CCGTGCCAGGACTGGGTCTT ela ACACGGTCAAGGAGATCAAC 513 51.0 [9] CGCTGGTGTTGGCCAGCAGG fla TCCAACCGTYTGACCTC 608 50.0 [9] GMYTGGTTGCGRATGGT 注:其中fla基因引物中的Y, M, R代表简并碱基,Y=C/T,M=A/C,R=A/G。
Note: Y, M and R in theflagene primer represent degenerate bases; Y=C/T, M=A/C, R=A/G.表 2气单胞菌耐药基因引物
Table 2Primers of antibiotic-resistant genes ofAeromonas
基因
Gene序列(5′−3′)
Sequence(5′−3′)长度/bp
Length退火温度/℃
Annealing temperature参考文献
ReferencesqnrA ATTTCTCACGCCAGGATTTG 519 49.4 [10] GATCGGCAAAGGTCAGGTCA qnrS ACGACATTCGTCAACTGCAA 417 51.0 [10] TAAATTGGCACCCTGTAGGC tetA GTAATTCTGAGCACTGTCGC 956 50.2 [10] CTGCCTGGACAACATTGCTT tetC TCTAACAATGCGCTCATCGT 588 50.5 [10] GGTTGAAGGCTCTCAAGGGC ant3 GTGGATGGCGGCCTGAAGCC 526 58.7 [10] ATTGCCCAGTCGGCAGCG sul1 CGGCGTGGGCTACCTGAACG 433 59.1 [10] GCCGATCGCGTGAAGTTCCG Tem AAAGATGCTGAAGATCA 425 45.0 [10] TTTGGTATGGCTTCATTC ctxM GTGCAGTACCAGTAAAGTTATGG 538 49.4 [10] CGCAATATCATTGGTGGTGCC strA TTGAATCGAACTAATAT 1640 40.0 [10] CTAGTATGACGTCTGTCG 表 3毒力基因鉴定结果
Table 3Identification of virulence genes ofAeromonas
气单胞菌Aeromonas 编号 Number ascV aexT aer act ast alt lip ela fla 嗜水A.hydrophila C1 − − + + + + + + + C2 − − + + + + + + + C3 − − + + + + + + + C6 − − + − + + + + + C10 − − + − + + + + + 达卡A.dhakensis C5 − + − + − − + + − C8 − − + − − + + + + C9 − + + − − + + + + 简达A.jandaei C7 − − − − + + + + + 维氏A.veronii C4 − − + + + + + + + 检出率/% 0 20 80 50 70 90 100 100 90 注:“+”表示检出,“−”表示未检出,下同。
Note: “+”represented detected, “−”represented non-detected, the same below.表 4耐药基因鉴定结果
Table 4Identification of antibiotic resistant genes ofAeromonas
气单胞菌Aeromonas 编号 Number qnrA qnrS tetA tetC ant3 strA sul1 tem ctxM 嗜水A.hydrophila C1 + + + + + − + + + C2 + + + + + + + + + C3 + + + + + + + + + C6 + + + − − + + + + C10 + − + − + + + + + 达卡A.dhakensis C5 + + + − + + − + + C8 + + + − + + + + + C9 + − + + + + + + + 简达A.jandaei C7 + + + + + + + + + 维氏A.veronii C4 + + + − + + + + − 检出率/% 100 80 100 50 90 90 90 100 90 表 5药物敏感性鉴定
Table 5Identification of antibiotic sensitivity
抗生素种类
Class of antibiotics药品名称
Antibiotics嗜水A. hydrophila 达卡A. dhakensis 简达A.jandaei 维氏A.veronii C1 C2 C3 C6 C10 C5 C8 C9 C7 C4 β−内酰胺类 头孢噻吩(30 μg·片−1) R R R R R R R R S I 头孢唑啉(30 μg·片−1) R R I R R R R R I R 阿莫西林(20 μg·片−1) R I R I R R R R R R 氨苄西林(10 μg·片−1) R R R R I I I R R I 头孢曲松(30 μg·片−1) S I I S S S I S S S 氨基糖苷类 链霉素(10 μg·片−1) R S S R S S S S S S 庆大霉素(10 μg·片−1) S S S S S S S S S S 卡那霉素(30 μg·片−1) S S S I S S S S S S 四环素类 米诺环素(30 μg·片−1) S I S S S I R I S S 四环素(30 μg·片−1) I S S S S S S S S S 喹诺酮类 依诺沙星(10 μg·片−1) S S S S I S S S S S 萘啶酸(30 μg·片−1) R I I I R S S S S S 环丙沙星(10 μg·片−1) S I S I S S S S S S 恩诺沙星(10 μg·片−1) S S S S S S S S S S 磺胺类 磺胺异恶唑(30 μg·片−1) R R R R R S R S I R 甲氧苄啶(5 μg·片−1) I R R R R R R S I R 糖肽类 万古霉素(30 μg·片−1) R R R R R R R R R R 氯霉素类 氯霉素(30 μg·片−1) S S S I I S S S S I 氟苯尼考(30 μg·片−1) S S S S S S S S S I 碳青霉烯类 亚胺培南(10 μg·片−1) S S S S I S S I R S 注:S. 高度敏感;I. 中介;R. 耐药。
Note: S: Sensitive; I: Intermediary; R: Resistant. -
[1] 马辰婕. 水产养殖源气单胞菌耐药基因的分布特征和传播机制[D]. 厦门: 集美大学, 2017. [2] 杨守明, 王民生. 嗜水气单胞菌及其对人的致病性[J]. 疾病控制杂志, 2006(5): 511 − 514.doi:10.3969/j.issn.1674-3679.2006.05.021 [3] 唐锡尔, 吴立奇, 车财妍, 等. 肝硬化并发气单胞菌属细菌性腹膜炎临床分析[J]. 肝脏, 2001(4): 281.doi:10.3969/j.issn.1008-1704.2001.04.037 [4] PU W Y, GUO G Y, YANG N, et al. Three species ofAeromonas(A. dhakensis,A. hydrophilaandA. jandaei) isolated from freshwater crocodiles (Crocodylus siamensis) with pneumonia and septicemia [J]. Journal of Applied Microbiology, 2019, 68(3): 212 − 218.doi:10.1111/lam.13112 [5] 蒲文渊, 曾纪锋, 郑挺, 等. 幼年暹罗鳄致病性简达气单胞菌的分离鉴定[J]. 中国预防兽医学报, 2018(12): 1181 − 1184. [6] 曾纪锋, 蒲文渊, 郭桂英, 等. 暹罗鳄致病性嗜水气单胞菌嗜水亚种的分离鉴定[J]. 热带生物学报, 2018, 9(2): 136 − 141. [7] MARTINO M E, FASOLATO L, MONTEMURRO F, et al. Determination of microbial diversity ofAeromonasstrains on the basis of multilocus sequence typing, phenotype and presence of putative virulence genes [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77(14): 4986 − 5000.doi:10.1128/AEM.00708-11 [8] CHACÓN M R, FIGUERAS M J, CASTRO-ESCARPULLI G, et al. Distribution of virulence genes in clinical and environmental isolates ofAeromonasspp. [J]. Antonie van Leeuwenhoek, 2003, 84(4): 269 − 278.doi:10.1023/A:1026042125243 [9] SEN K, RODGERS M. Distribution of six virulence factors inAeromonasspecies isolated from US drinking water utilities:a PCR identification [J]. Journal of Applied Microbiology, 2004, 97(5): 1077 − 1086.doi:10.1111/j.1365-2672.2004.02398.x [10] DENG Y T, WU Y L, TAN A P, et al. Analysis of antimicrobial resistance genes inAeromonas spp.isolated from cultured freshwater animals in China [J]. Microbial Drug Resistance, 2014, 20(4): 350 − 356.doi:10.1089/mdr.2013.0068 [11] CLSI. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: twenty-fourth informational supplement. CLSI document M100-S24[S]. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2014. [12] IGBINOSA I H, IGBINOSA E O, OKOH A I. Detection of antibiotic resistance, virulence gene determinants and biofilm formation inAeromonasspecies isolated from cattle [J]. Environmental Science and Pollution Research, 2015, 22(22): 17596 − 17605.doi:10.1007/s11356-015-4934-4 [13] 胡萌. 江苏地区气单胞菌分离鉴定及强毒株生物学特性分析[D]. 南京: 南京农业大学, 2012. [14] 吴亚锋. 南京地区气单胞菌的分离鉴定及嗜水气单胞菌菌株分型研究[D]. 南京: 南京农业大学, 2015. [15] 范腾飞. 气单胞菌的毒力基因检测及环境因子对毒力基因表达的影响[D]. 合肥: 合肥工业大学, 2013. [16] TRUDEL M V, VINCENT A T, ATTÉRÉ S A, et al. Diversity of antibiotic-resistance genes in Canadian isolates ofAeromonas salmonicida subsp. salmonicida: dominance of pSN254b and discovery of pAsa8 [J]. Scientific Reports, 2016, 6: 35617.doi:10.1038/srep35617 [17] 何秋丽. 气单胞菌的耐药现状及对喹诺酮类抗生素耐药机制的研究[D]. 杭州: 浙江大学, 2015. [18] 李皇. 气单胞菌及其感染研究进展[J]. 华北煤炭医学院学报, 2008(6): 769 − 771. [19] CARNAHAN A M, BEHRAM S, JOSEPH S W. Aerokey Ⅱ: a flexible key for identifying clinicalAeromonasspecies [J]. Journal of Clinical Microbiology, 1991, 29(12): 2843 − 2849.doi:10.1128/JCM.29.12.2843-2849.1991